在全球向可持续农业转型的背景下，生物制剂在植物保护领域变得越来越重要。 除了具有有机农业所需的环保和无残留特性外，它们铺助化学合成农药的使用，从而强化了虫害综合治理方案 (IPM) 的实施。
在不同种类的微生物制品中，细菌和真菌在当今的应用领域中占有重要地位，例如芽孢杆菌，木霉菌，白僵菌，淡紫拟青霉菌，绿僵菌。为了使这些生物制品在叶面、土壤或种子施用中发挥最佳性能，它们在上市时通常要经过加工和/或配制以整合所需的特性。 合适的配方是微生物活性物质、次生代谢物（在某些情况下）和惰性成分的均匀且稳定的混合物，从而使产品更易于使用和更有效。然而，浓缩制剂有限的保质期是减缓生物农药在全球推广的主要原因之一。 事实上，对储存条件（通常在低温下）的严格要求，加上终端用户担心生物农药药效不稳定是此类制剂的主要限制因素。
配制真菌生物农药的挑战
为了延长微生物农药的保质期，通常首选无水介质以避免过早萌发。 实现这一目标的最常见方法是开发固体配方，例如可湿性粉剂 (WP) 和水分散粒剂 (WDG)。 然而，尽管这可能对大多数芽孢细菌（如芽孢杆菌）有效，但许多真菌孢子在工业干燥过程中对相对高温的抵抗力较差。
为了免受干燥过程中的高温和更便于用户使用，通常以矿物油或植物油（如大豆油，菜籽油）为介质的油悬(ODs)配方更适合真菌型生物农药。几项研究 [1-4] 也强调了油能促进昆虫病原真菌的生物功效，例如，乳化菜籽油被证实可与白僵菌胚泡发生协同作用，导致目标害虫死亡率的增加。这种增效机理的假设包括通过薄油层防止有益的真菌孢子干燥，更好地粘附到亲脂性昆虫角质层，或者更容易传播孢子以感染昆虫身体的易感部位[1-4]。
尽管已证明油基制剂对提高生物功效有好处，但制备工艺仍然很复杂，并且需要加入乳化剂、流变改性剂、分散剂这些通常对孢子活力有不利影响的助剂。由于真菌分生孢子的脆弱性质，真菌生物农药长时间在室温或高于室温条件下的储存稳定性是一个特殊的挑战。 作为制剂配方领域 40 多年的专家，索尔维致力于提供创新和高性能的配方助剂，以加速全球向可持续农业的转型，并一直在开发具有良好物理稳定性、延长保质期和应用特性的真菌农药 OD 配方的具体解决方案。
真菌生物农药油悬的优秀乳化剂
配方设计师面对的第一个挑战是选择对真菌无毒（孢子活力）、含水量低的温和助剂，以避免孢子过早萌发，从而确保生物稳定性和需要的物理特性。
文献[5]利用抑菌圈测试法对各种乳化剂在1-5% 不同质量浓度下与两种分生孢子真菌哈茨木霉（菌株 CCT 4790）和白僵菌（ATCC 7159）的相容性进行了研究。一旦微生物菌株被激活并萌发，该方法可以预测其在配方稀释和应用时的潜在存活力问题。在十种被测产品中，某些脱水山梨糖醇酯或蓖麻油乙氧基化衍生物，如 Alkamuls® OL40、RC 和 VO2003，成为这些分生孢子物种的有吸引力的乳化剂技术。Alkamuls® VO2003 是一种适用于各种植物油的非常通用的乳化剂技术。
表1：可用于真菌孢子油悬配方的乙氧基化脱水山梨糖醇酯和乙氧基化蓖麻油乳化剂
AgRHEA™ OD-EASY，一种强大的即用型真菌生物农药油悬解决方案
生物农药油悬配方的第二个挑战是在满足储存时的微生物活力的基础上，实现配方浓缩物的良好物理储存稳定性，避免出现严重的沉降或结块（通常析油率小于 15%）。入水后良好的悬浮率和乳液均匀性也是必需的，防止产生颗粒聚集而可能导致喷嘴堵塞。
AgRHEA™ OD-EASY 即针对这些问题而开发，它是一种最佳的一体化油悬配方解决方案，复配了互相兼容的乳化剂、分散剂和植物油基流变改性剂，具有良好的性价比。 这种多功能解决方案为配方提供了强大的性能、广泛的储存稳定性和均匀的稀释特性。
图 1: 20% 白僵菌在AgRHEA™ OD-EASY/大豆油混合物中的油悬配方示例
图 1 给出了一个油悬配方案例：将 20% 的白僵菌（粉末，1.2x1011CFU/g）混合到含有 45% 的 AgRHEA™ OD-EASY 的大豆油中。
微生物存活力用来表征AgRHEA™ OD-EASY与微生物原药白僵菌和哈茨木霉的兼容性。测试方法为：将5%微生物原药加入到95%的载体（含有45% AgRHEA™ OD-EASY和50%大豆油）中，总量为20ml，按照表2所列条件静置培养。为了比较，不含AgRHEA™ OD-EASY的大豆油载体用作对照。每个试验重复两次，并在 0、7 天、15 天和30天进行活力评估，每个试管混合均匀后测试。为了获得可靠的量化结果，需在1%吐温80溶液中进行连续稀释，然后在琼脂培养基中接种不同的稀释液。培养琼脂板直到真菌菌落生长并可以计数。几次重复试验的微生物计数平均值 (CFU/mL)作为最终结果。
表 2: 微生物培养条件。
[*]该研究对应于加速老化测试，因为在实际条件下，配制的产品通常在 4°C下储存
图2: 一个月内加速条件（25°C/30°C）下白僵菌和哈茨木霉在不同液体载体中的微生物活力变化（CFU/mL）
如图 2 所示，对于白僵菌和哈茨木霉，AgRHEA™ OD-EASY 的配方在培养条件下随着时间的推移微生物活力衰减最慢。 一个月结束时，AgRHEA™ OD-EASY 载体中的微生物活力保持在 107 CFU/mL 以上，而在对照组大豆油中微生物活力降低了 10 倍。 我们对另一种已商业化的基于乳酸异辛酯的液体载体也进行了平行测试，在培养一个月后，发现其对微生物的存活力产生了严重的不利影响。 AgRHEA™ OD-EASY延长不同真菌分生孢子保质期的优越特性使其成为各种真菌油悬配方的理想选择。
创新的生物基液体载体可延长室温下的保质期
除了 AgRHEA™ OD-EASY 等基于植物油的解决方案外，索尔维目前正在开发创新的生物基液体载体，以解决具有更高保质期延长目标的更大范围的真菌生物农药。
根据前面描述的实验程序，我们对白僵菌和淡紫拟青霉菌进行了微生物活力研究。 如图 3 所示，Carrier DV SolvExpe066 和 Carrier DV SolvExpe067 在至少 8 个月的跨度内对这两种真菌生物农药都表现出卓越的保质期延长特性。
图 3：8 个月内在加速条件（25°C）白僵菌和淡紫拟青霉菌下在不同液体载体中的活力变化（CFU/mL）
这为新一代有益真菌的浓缩配方铺平了道路，在室温/高于室温下延长保质期，更方便最终用户使用产品，并且有可能产生更好的生物功效。
总之，为了应对伴随当今可持续农业转型而采用微生物型生物农药的重要挑战，索尔维研究了用于提高真菌浓缩制剂（尤其是油悬配方）保质期的不同解决方案。
重点介绍了三种温和且用途广泛的乳化剂（Alkamuls® OL40、RC 和 VO2003），它们与主要的真菌生物农药表现出良好的生物相容性。 此外，我们还开发了一种具有良好性价比的一体化油悬配方解决方案 AgRHEA™ OD-EASY，以提供在室温/高于室温的长期储存稳定性和良好的稀释均匀性。 此外，其他生物基液体载体目前正在开发中，其配方在室温下8 个月的存储条件下，白僵菌和淡紫拟青霉菌依然显示出足够的微生物活力。
除了延长保质期的解决方案外，索尔维还致力于支持生物农药制剂公司优化配方策略以提高生物功效。 索尔维工具箱中的其他技术可用于提高润湿性、持留性/耐雨性（AgRHEA™ SticGuard）、分散均匀性或满足特定的种子处理要求。 如需更多信息，请将您的询问发送给我们的生物防治技术专家Ling Qi (ling.qi2@solvay.com).
参考文献
[1] Prior et al., J. Invertebr. Pathol., 52 (1988), pp. 66-72
[2] Bateman et al., Ann. Appl. Biol., 122 (1993), pp. 145-152
[3] Ibrahim et al., Mycol. Res. 103 (7) : 901–907 (1999)
[4] https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2019.104106
[5] Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK 2016. Methods for in vitro evaluation antimicrobial activity: A review. J Pharm Biomed Anal. 6(2): 71-79.
