作者信息:我叫Roberto Sardinha,于2001年获得圣保罗大学(USP)化学学位。完成学位后,即有机会加入一家杀虫剂家族企业,开始农药生涯。2004年,我加入 Bioagri 实验室,现在叫 Mérieux NutriSciences,在这里我有机会开展各种研究工作。如,动物代谢和五批次全分析等,我担任五批次全分析主任已有5年。此后在公司不同岗位都做过,但我一直关注着五批次全分析发展进程。


在本文中,我将与大家讨论五批次全分析研究,以及在人类健康、环境方面对产品功效进行研究的重要性。

 

 五批次全分析在登记过程中的作用 


这项工作的重要性可以简单理解为:运用化学品组分知识、成分知识,预估产品人类和环境安全性。


在等同性登记过程中,会将被测试产品的组分分布与对照产品进行比较。对照产品的组分分布是已知的,已经做过所有毒理学和生态毒理测试。因此,当被测产品的化学组分等同于对照产品组分时,对照产品的所有毒理学和生态毒理知识被视为等同。


″原药产品可被视为等同物,即:各种无相关杂质的最高水平,未增加50%以上,相对于原药对照产品的最高水平而言;或当绝对最高水平未增加 3克 /公斤以上时(以最高增量水平为基准),相对于无相关新杂质、且相关杂质最高水平未增加的情况而言。″(法令) 4074.2002。

 

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化学事业部

 五批次全分析 


五批次全分析包括数个分析,对原药产品开展代表性五批次分析,在特定制造现场、依据特定制造工艺进行,五批次分析提供被测产品的全部化学成分。


我所说的全组分,是指活性成分特性及数量,以及显著杂质(≥1克 / 公斤);同时进行毒理分析,根据各监管机构(如FAO,EFSA等)发布的技术规范进行。


组分分布须达到至少980 克 / 公斤的量化特性。


五批次全分析的第一步,也是最重要的一步,被称为筛分分析,然后是活性成分量化、特性测定,以杂定性、特性测定。


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质谱分析实验室


 筛分分析 


筛选分析旨在测定组分中存在的杂质或上述显著杂质。


产品中可能存在的杂质


由于这是原药农药产品,制造工艺是已知的,生产所用原材料来源也是已知的,因此这并非盲源分析。根据知识能力,杂质可能会是:

  • 未耗尽的原材料

  • 未耗尽的中间体

  • 副产品


为此,第一步就是要列出可能存在的上述杂质,准备所需对照材料,采用适当方式检测被测样品中的杂质水平。


第二步是扫描分析,可以检测不应该存在的杂质及副产品,无对照材料。


这项分析通常采用色谱技术,针对活性成分的化学特性和可能存在的杂质;在多数情况下,LC-DAD-MS 系统是这项检测的最佳选择。即:


LC – 液相色谱法,促使杂质和活性成分分离。


DAD – 二极管阵列检测器,检测色谱柱中分离后的物质信号;DAD可以记录一系列波长,提供所选波长的色谱图及色谱3D图,显示全部记录范围内的信号。


MS – 质谱法,提供定性信息,如DAD检测到的峰值 m / z,表示杂质的化学特性。

 

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图1 – 筛分分析典型DAD色谱图


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图2 – 碎片杂质典型质谱



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图3 – 3D色谱图


筛分分析的结果是,得到一份显著杂质清单,这些杂质均进行量化,具有各自特征。


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筛分色谱 3D 图

 

 杂质特征或鉴定 


在某些情况下,筛分分析中获得的质谱,可以确证杂质特性,这种情况发生在杂质与活性成分差别非常清楚和近似时。所以,无论如何,出于监管考虑,企业应主动提供详尽数据,以确认杂质特性。


一旦杂质的化学特性清楚、明确,则可以进入对照材料,继续后续步骤。


然而,质谱通常并不足以确定杂质的分子结构。在这种情况下,正常程序是将杂质从被测样品中分离出来,数量和纯度均应得到保证,以便进一步采用光谱、分光技术,清楚、明确地清除其分子结构。这一点出现任何质疑,都会招致监管机构提出更复杂的要求。


定性可使用的技术有:质谱碎片分析、高分辨率质谱分析、(HRMS)、不同配置(H 1-NMR,C 13-NMR,COSY,NOESY等)中的核磁共振(NMR),以及所需的其他技术。


最后,杂质特性至少应以分子结构、分子式、化学名称、CAS号表示。


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残留实验室

 

 显著杂质的量化 


通常情况下,筛分分析使用同样的色谱法,进行杂质量化。


然而,该方法用于量化需要进行调整,且必须进行验证;用于定性的对照材料可以用于量化。


该方法的验证,须遵循国际公认的协议,涉及测试线性、精度、准确度,检测极限等参数,以及量化要求。


验证结果的验收标准根据协议确定, 一旦各项要求达成,则可以运用该方法。


分析五个样本,数量以 % 或克 / 公斤表示。

 

 活性成分的量化和鉴定 


这属于已知物质,所以其活性成分的量化和鉴定,不如杂质具有挑战性。


活性成分的鉴定须通过至少两种方式,通常使用 MS和NMR与对照材料进行比较。


对于量化,开发及验证方式是液相色谱法;或者在某些情况下,使用气相色谱法,如果活性成分是常规有机化合物的话。


若涉及无机物,方法则完全不同,本文不予赘述。


如对待杂质一样,方法的验证须遵循国际公认协议,结果以 % 或克 / 公斤表示。


 相关杂质分析 


相关杂质属于已知毒理,由不同监管机构(如FAO、EFSA、IUPAC、INC 02/2008(巴西)等)确定最大限值。


研究五批次分析之前,需要了解这些规范,这很重要,这是为了能够更好地策划、实施分析工作。


相关杂质的分析目的是,达到最大既定水平下的量化极限,须使用按照国际协议验证的方法进行分析。


由于某些参数水平较低,相关杂质的分析要使用灵敏、选择性技术和方法;质谱法是多数相关杂质分析的最佳选择。


请参阅部分示例:

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 其他分析 


以上为五批次全分析的关键、重要步骤,在重要补充分析配合下,可实现质量平衡,显示所有显著杂质,使产品满足监管机构 980 克 / 公斤的最低要求。


一旦分析了所有有机杂质和活性成分,则可以分析可能存在的无机物和溶剂,应参照被测产品的制造工艺进行分析。


这些物质涉及各种技术,如下所示:

  • 水 – 卡尔·费歇尔滴定

  • 金属 – ICP/OES,原子吸收

  • 离子 – 离子色谱

  • 溶剂 – GCMS

   

上述所有分析,均须采用国际导则规定的验证方法;结果以 % 或 克/公斤表示。

 

 结果 


全部研究结果以以下表格归纳、展示,包括所分析的五批次全分析组分图,如下:

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(1) ND = 未检出(低于检测限值)

 

 结论 


五批次全分析研究结果,提供了整个组分分布,基于五批次测试产品的分析结果。


该结果可用于登记人的产品组分分布说明,包括最低活性成分含量和最大杂质含量。


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皮拉西卡巴测试场地

 


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