世界农化网中文网报道：草铵膦（PPT）是一种广谱除草剂，但只有L-草铵膦(L-PPT)具有除草活性。为了有效地生物合成L-PPT，所使用的生物催化剂必须具有高度的选择性、对底物的耐受性和热稳定性。转氨酶（TAs）是一类重要的参与L-PPT生物合成的酶，TA分为PLP折叠I型和IV型，折叠I催化合成L-对映体。但一些用于不对称合成L-PPT的TA存在低的平衡常数，导致不利的热力学平衡，通过多酶级联反应去除副产物可以有效地改变转氨反应中的反应平衡，但目前没有很好的用于工业生产L-PPT的生物催化剂。基因挖掘和蛋白质工程常用于获得新型生物催化剂，采集和鉴定从极端环境中分离出来的微生物，是发现能够经受工业生产条件生物催化剂的有效策略。


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图1. L-PPT生物合成的多酶级联体系


2024年1月30日，浙江工业大学（Zhejiang University of Technology）生生物工程学院院长、国家化学原料药合成工程技术研究中心副主任郑裕国团队，在《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志发表了题为″Identification of a novel thermostable transaminase and its application in L‑phosphinothricin biosynthesis″ 的研究论文，在这项研究中，研究者本通过序列挖掘和结构功能分析，从耐热假单胞菌中获得了一个活性高、稳定性好的耐热TA(PtTA)。随后，研究人员为了评估其在实际应用中的潜力，分别以PPO和D,L-PPT为起始底物开发了两个级联体系(图1)。通过采用PtTA驱动的级联体系，实现了高底物浓度下L-PPT的生物合成，其反应具有优异的催化性能，克服了热力学限制，在L-PPT生物合成中具有广阔的应用前景。


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图2. PtTA与关键活性中心残基的同源建模


该研究首先对耐热转氨酶的基因进行了挖掘。为了获得具有预期功能的新型转氨酶，选择能够从多酚合成L-PPT的转氨酶SeTA为模板进行同源搜索。在NCBI蛋白质数据库中进行基因序列的筛选和比对，从不同物种中挑选具有30%-80%同源性的TA序列构建系统发育树。同时研究者根据对结构和功能关系的理解，对活性位点残基进行识别，推测PtTA可以接受PPO作为底物。随后，研究者将PtTA基因克隆在大肠杆菌中进行了表达纯化，并以L-丙氨酸为氨基供体，测得PtTA对PPO的比酶活为1.62U/mg。


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图3. PtTA的SDS-PAGE分析


接下来，研究人员对PtTA的氨基供体特异性进行了探究，并对PtTA的性质进行了表征。研究者发现PtTA更喜欢以L-谷氨酸作为氨基酸供体，其次是L-丙氨酸。研究人员进一步考察了温度和pH对酶活性和稳定性的影响，并对其性质进行了表征。结果显示，PtTA的最适pH为8.0，在pH 7.5~9.0之间有80%以上的相对活性。PtTA在pH 7.0~9.0范围内稳定，孵育24 h后仍保持85%以上的活性。同时，当PPO浓度为600 mM时，L-PPT的产率仍达53.48%，与低浓度(20-200 mM)相似，表明PtTA具有较好的底物耐受性。


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图4. PtTA的表征


随后，研究人员对PtTA的动力学参数进行了测定。研究结果显示，PtTA的Km值为35.85 mM，与报道的转氨酶相似。此外，PtTA的kcat/km值(0.73 S−1 mM−1)分别是研究者先前报道的PfTA (0.33 S−1 mM−1)和SeTA(0.30 S−1 mM−1)的2.21倍和2.43倍。结果表明，PtTA对PPO的催化效率具有明显优势。


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图5. 不对称合成L-PPT的体内三酶级联反应的构建


接下来，研究者尝试通过三酶级联法从PPO不对称合成L-PPT。为了克服不利的热力学平衡，研究人员通过耦合PtTA、GluDH和GDH设计了一个生物催化级联系统。研究者也构建了体内级联表达系统，并进一步优化了催化反应条件以及反应体系中各组分的浓度。结果表明，在最佳反应条件下，当OPP浓度低于400 mM时，其可在12 h内完全转化为L-PPT，而在500 mM PPO下，14 h可达到98.36%的转化率。


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图6. 重组E. coli G.不对称合成L-PPT


研究人员进一步使用双转氨酶级联一锅法对D,L-PPT进行去消旋化。基于研究者之前的研究，Ym DAAT对D-PPT具有较高的活性,因此，采用Ym DAAT催化D-PPT和PPO之间的氨基转化，然后在PtTA催化下从PPO合成L-PPT，并通过氨基供体和PtTA的巧妙结合，产生可以作为Ym DAAT氨基受体的副产物。研究者进一步探究了反应体系各组分的浓度和酶的比例，在最佳反应条件下， L-PPT的产率在90%以上，反应体系在最高底物浓度条件下也表现出优异的催化效率。


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图7. D,L-PPT的双转氨酶级联去消旋化


在该研究中，研究者发现了一种具有良好活性、稳定性和底物耐受性的新型耐热转氨酶PtTA。确定了PtTA的关键活性中心残基。在此基础上，开发了两个PTTA驱动的多酶级联系统，探索了其在L-PPT生产中的应用。利用PPO不对称合成L-PPT，将PtTA、LsGluDh和EsGDH三酶级联，构建了体内三酶级联重组E. Coli G，实现了400 mM PPO的完全转化。此外，还构建了两个转氨酶的级联反应，利用一锅法对D,L-PPT进行去消旋化，在最高底物浓度下获得了90.43%的产率。这些优良的催化性能表明，转氨酶驱动的级联体系在克服热力学限制有效地合成L-PPT方面表现出了巨大的效率，在L-PPT生物合成中具有广阔的应用前景。