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生物农药通过使用活体生物、天然物质或信息素，防止或减少害虫和病原体造成的损害，此类农药正成为前景最为广阔的可持续农用产品之一。它们不仅对合成农药活性成分的应用做了补充，还降低了抗性产生的风险，从而加强了有害生物综合治理（IPM）的推广。扩大这类产品应用的驱动因素包括消费者对有机和无农残食物的需求，人们担心传统农药对环境、生物多样性和健康造成不利的影响，以及农用化学品受到的监管压力不断加大。在这种情况下，欧盟的“从农场到餐桌”战略，以及巴西的“国家生物投入品计划”都制定了明确的目标，有助于减少传统农用化学品的使用。生物防治产品中，有益微生物的使用占生物农药总市场份额的58%以上1。
但与传统农药相比，全球采用微生物防治方案的比率仍相对较低，在不利的条件下，田间生物制品功效一致性较差。典型的根本原因包括产品在储存过程中的稳定性欠佳，接触到靶标的活性物质较少，以及生物农药受环境因素的影响而快速降解。因此，优化配方是提高全球生物农药功效的关键。
选择适当的助剂尤其重要，其影响包括：
- 保质期更长，微生物活力增强
- 配方稀释后的润湿性和均匀分散性令人满意（喷嘴不被堵塞等）
- 控制喷雾液滴大小，以实现最佳覆盖（叶面和土壤）
- 改善微生物农药润湿性、附着力、保湿性和耐雨水冲刷性
- 提高包衣种子所使用的微生物的存活率
- 提高针对靶标病虫害的微生物活性，并提高有益代谢物的生物可利用性
然而，微生物农药的配方并无通用的解决方案：每种有益微生物对化学品、水、温度、环境因素（如紫外线、干旱和湿度）的敏感性均不相同。视微生物农药的作用模式及其靶向表面的不同，最终配方所需的功能可能会有很大的差异，例如，助剂需要提供耐雨水冲刷性、保湿性，以及改善增润性和溶解性。以枯草芽孢杆菌或解淀粉芽胞杆菌为例，为了使细菌发酵产生的脂肽具备良好的生物可利用性，提高其溶解性，以便获得足够的抗真菌活性，助剂的选择至关重要。此外，特定的菌株和发酵过程会对最终培养基的成分产生重大影响，包括影响其配方方法和生物性能。
在这项工作中，研究人员评估了60多种助剂对4种关键微生物（有益真菌或细菌）活力的影响，其中包括两种生物杀菌剂（枯草芽孢杆菌CCT0089和哈茨木霉CCT4790），以及两种生物杀虫剂（苏云金芽孢杆菌CCT2335和球孢白僵菌CCT3161）。
助剂的选择主要依据其为靶向微生物农药提供的功能性、相关制剂类型，部分制剂需要遵从美国环保署（EPA）NOP法规标准，以及无（或低）危害的考虑。为检验助剂（1%～5% w/w）与以上4种微生物的兼容性，研究人员采用了抑制区实验法（一种适用的琼脂盘扩散方法2）： 6只6mm直径的空白片先用每种助剂溶液浸透，之后放置在先前接种了0.5ml微生物细胞的培养皿中等待观察。水与过氧化氢（50%）分别作为阳性与阴性对照。如果助剂抑制了微生物的生长或将其杀灭，则对圆周抑制区的径向长度进行测量。这种方法用于预测在配方稀释和应用过程中，一旦微生物菌株被激活并发芽，这些微生物菌株潜在的生存可能。
图1：苏云金杆菌抑制区试验：左图 - 对微生物生长无负面影响的助剂；右图 - 对微生物生长有明显抑制作用的助剂。*两个平板右下方的圆盘代表没有抑制作用的对照（水）。
表1显示了20种助剂的结果：
表1：抑制区试验，助剂与4种微生物的兼容性
深绿：1%或5%助剂无抑制；
浅绿：5%助剂轻度抑制，1%助剂无抑制；
橙色：在1%和5%助剂下观察到显著抑制（径向抑制区2～11mm）；
nt：未测试；
*符合美国EPA的国家有机计划（NOP）：CAS# 在清单4A或清单4B下，因此具有获取OMRI有机认证的资格。
有趣的是，Soprophor® BSU、4D/384和796/P，Antarox® 25-R-2和L-62 EO/PO共聚物，Antarox® B600，Supragil® RM/210-EI和Geropon® T36作为可湿性粉剂（WP）、水分散粒剂（WDG）或悬浮剂/流动剂（SC/FS）的润湿剂或分散剂，展现了与受试菌株之间良好的兼容性。针对球孢白僵菌，为使其真菌分生孢子在适当的储存期内保持休眠状态，通常需要在无水介质（如植物油）中配制，Alkamuls® T20、RC或OL 40可作为优良的乳化剂选择。
Geronol® Odessa 01是一种即用型多功能植物油基配方，含有乳化及分散剂体系，以及用于达到充分稳定的流变改性剂，可为球孢白僵菌或哈茨木霉的配方提供有效的解决方案。
在首次生物相容性评价后，研究人员进一步测试了某些特定助剂，以确定其稀释后是否有利于微生物生长，并进行了应用和药效试验。在下列例子中，一项微生物生长研究分别在含和不含有AgRHEA™ SticGuard（一种基于瓜尔豆胶的粘附剂和耐雨水冲刷剂）的条件下进行。在该实验中，这些微生物被分别接种在含有1%（w/v）AgRHEA™ SticGuar的介质和对照介质（不含AgRHEA™ SticGuar）的实验培养基中。所有的样液均在30°C 下，保持150 rpm的搅拌速度培养96小时，并每24小时取样一次进行菌落计数或干重测量，以计算微生物生长速率并与对照试验进行比较。如图2所示，在含有1%（w/v）AgRHEA™ SticGuard的情况下，观察到所有受试微生物的生长都有显著增加，表明其存在提高微生物生存能力的作用。
图2：存在AgRHEA™ SticGuard条件下细菌或真菌生长率的相对增长
通过与BIOTRANSFER研究服务公司合作，AgRHEA™ SticGuard对微生物农药的粘附性和耐雨水冲刷性的改进作用，在生物功效试验中进一步得到了验证。研究人员按2.5kg/ha（300L/ha喷雾量）的用量，以0.07%（w/v）AgRHEA™ SticGuard的剂量添加（或不添加），或以0.1%（w/v）商用合成胶乳基耐雨水冲刷剂的剂量添加，将一种基于淀粉解芽孢杆菌菌株的商业生物杀菌剂施用于葡萄叶上，然后在接种灰霉病菌株的校准悬浮液（105个孢子/ml）之前，对一些样品施加20mm或40mm的人工降雨。接种4天和6天后，计算病害占葡萄叶总面积的百分比以分析病害强度。每个系列实验重复6次。生物功效由AUDPC3值确定，以%表示，并与空白对照组相对照。
如图3所示，与对照（不添加助剂）组和商业基准相比，AgRHEA™ SticGuard不仅在无雨情况下提高了微生物功效（12-22%），而且在小雨（20 mm）情况下也展现出了更重要的协同增效功能。这种功能被认为与水分促进解淀粉芽孢杆菌的生长或雨水对产品的再分散有关。此外，在模拟大雨（40mm）的条件下，无助剂参照体系的生物功效被完全消除，这可能与生物农药溶液完全被洗去有关，但在助剂（尤其是AgRHEA™ SticGuard）存在的条件下，生物功效则被极好地保存下来。
图3：助剂对商业解淀粉芽孢杆菌WDG（经过/不经过20 mm、40 mm 两种雨水量淋洗）生物功效的改善
综上所述，得益于汇集了微生物学、物理化学和农用制剂配方专业知识的多学科方法，一系列助剂被视为对微生物农药配方设计极具吸引力的产品。可生物降解的天然聚合物AgRHEA™ SticGuard被证明能同时提高微生物的功效和耐雨水冲刷性。
索尔维的产品中还有其它一些技术，也可用于解决微生物及其代谢物稀释过程中观察到的润湿、凝聚、聚集等问题。对于生物制剂在种子处理中的应用，不含微塑料的AgRHO® BIOBINDER粘合剂，或与微生物有协同作用的AgRHO® S-Boost生物刺激剂系列，均为可持续地提高生物功效铺平道路。
参考
[1] AgrowBiopesticides, 2019
[2] Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK 2016. Methods for in vitro evaluation antimicrobial activity: A review. J Pharm Biomed Anal. 6(2): 71-79.
[3] AUDPC: Area Under Disease Progress Curve, Madden et al. 2007.
本文首登于AgroPages世界农化网商业杂志《2021生物制剂专刊》，点击免费下载阅读！
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