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Carlos Eduardo Oliveira da Silva
禾大首席研究员
为了生产高度稳定的微生物制剂，禾大首席研究员Carlos Eduardo Oliveira da Silva在制剂成分与微生物兼容性方面，探索出了多种测试方法。本文将介绍禾大全新的专利技术，并进一步阐述这些测试方法如何在配方设计方面提供支持，帮助配方师找到最佳解决方案。
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全球农业生产中，使用有益的微生物来防治农业中的虫害已成为了公认的方法，并得到了广泛应用。生物农药（biological control agents）在农业中的应用历史可以追溯到几个世纪前，中国是最早应用生物农药的国家之一，可以追溯到约5000年前。那时的柑橘种植者使用捕食蚁来防治其他啃食柑橘树叶的蚂蚁。18世纪到19世纪，中国第一次引入病毒和真菌来防治害虫。
自此， 生物农药的应用越来越广泛。与传统农药相比，生物农药在某些特定情况下对病虫害的防治效果更好。人们不断改进配方设计，开发新的应用技术，一系列举措促进了全球生物农药市场的发展。截止至2020年，全球生物农药市场已增长到43亿美元，预计2025年将超过80亿美元。虽然生物农药这一领域已经取得了长足的进步，仍需不断发展创新才能创造出受市场欢迎的成功产品。在微生物制剂的开发中，分析方法是重要的环节之一，用来测试制剂成分（和制剂本身）对微生物存活率的影响。
测试方法多种多样，本文中，我们将针对如何测试制剂组分对微生物存活率的影响进行探讨，每种方法在其复杂性、易用性和结果的详细程度等方面都存在各自的优缺点。
1. 抑菌圈法或Kirby-Bauer(K-B)法
使用抑菌圈法或K-B法，可以快速简便地分析不同成分对微生物的影响（可以根据产品特性进行调整）。使用K-B法得到的结果实例见图1。
图1：采用K-B法测试不同成分对Muller-Hinton-Agar（MHA）培养基中的芽孢杆菌的影响。A为对照组（只使用无菌水），B显示轻度不良影响，C显示严重不良影响（来源：禾大内部数据）。
K-B法快速、易操作，因此被广泛应用于日常的微生物实验中。然而，无论抑菌圈大小如何，K-B法都无法判断造成这种现象的具体原因。例如，在这次测试中，K-B法无法确定该成分具有的是杀菌还是抑菌作用。此外，K-B法只提供外观视觉信息，因此要考虑到微生物本身特性及田间施用情况等，将前后信息联系起来才能得出更加全面的结论。K-B法对于最初筛选配方很有效。禾大就是通过这种简单的方式来确定哪些产品可以用于配方开发。
2. 平板计数（CFU）法
另一种被广泛使用的方法是CFU法。这种方法可用来估算活菌（细菌或真菌）的数量，进而确定样品中微生物的浓度，从而推断出在特定环境条件下微生物产生菌落的能力。采用CFU方法的测试结果见图2。
图2：采用平板计数法（CFU）得到的结果。图中显示，25℃时，在马铃薯葡萄糖-琼脂（PDA）培养基中培养棘孢木霉。3天后可以观察到，不同纯度等级的分散剂如何影响菌落数量（来源：禾大内部数据）。
CFU法具有以下几个优点；易操作（不需要复杂的设备或特定的装置），几小时后就可以得到结果（具体时间取决于所分析的微生物或菌株的种类），这种方法广泛用于测试市售产品的保质期。由于一个单菌落可能产生自一个或多个细胞，样品的活菌数并非一个准确数值，所以CFU法只能提供活菌数的估值。聚集在一起的多个细胞会被误计为单一菌落，这也是测试结果以CFU/mL（或g）表示而不是以细胞/mL（或g）表示的原因之一。
3. 分生孢子萌发法（或直接成活率法）
对于真菌分生孢子，我们会使用分生孢子萌发法（或直接存活率法）。与上述两种分析方法相比，这种方法可提供样品中有活性的分生孢子数量的准确数值。此外，使用这种方法可以在一次测试中，确定已萌发的分生孢子、未萌发但已激活的分生孢子（即有活性的分生孢子，但由于培养时间短而尚未萌发）和无活性的分生孢子。这种方法能够获取关于制剂成分（或整个制剂）如何影响真菌生存的精确信息，并且能几小时后就得到结果（具体时间取决于所分析的菌种菌株），同时还可以测试不同成分对分生孢子活性的长期影响。在一些应用中，这种方法可以确定该成分在一段时间内是否具有杀菌或抑菌作用。结果见实例图3。
图3：25℃时，在PDA培养基中培养棘孢木霉，15小时后，用分生孢子萌发法对棘孢木霉进行检测的结果。我们可以观察到常规表面活性剂（A）和高纯表面活性剂（B）对分生孢子活性的影响。红色箭头所指为无活性的分生孢子，绿色箭头所指为萌发的分生孢子和有活性但未萌发的分生孢子。
使用萌发法可以直观地观察到制剂组分如何影响真菌分生孢子的活性，并以有活性的分生孢子百分比来准确地量化这种影响。这种方法的缺点之一是时长，主要是测试过程比较耗时，且需要使用至少放大100倍并内嵌高清摄像头的光学显微镜，还需要在培养期进行精确的环境防治，因为在这个阶段任何温度偏差都会给结果造成极大影响。
4. 禾大最新PrecisionBio™软件测试法
对于真菌分生孢子我们不仅要测试萌发能力，对其活性的测试也十分重要。有些产品主要影响的是分生孢子的活性，进而影响真菌的田间施用效能。为此，我们开发了一款软件PrecisionBio™，通过对光学显微镜获得图像进行数字处理，来确定分生孢子活性随时间的变化。图4是使用PrecisionBio™软件获得的结果。
图4：PrecisionBio™软件界面和经图像处理后的结果。A图为PrecisionBio软件的用户界面，B图为加入制剂成分180天后，与分生孢子的活性相关的原始数据，C图是通过软件获得对数据集的分析结果（例如，计算分生孢子活力曲线下的面积。采用Dunnett法检验，字母标示的数据(柱状图)之间存在统计学上的差异，α=0.05）。
该软件可以确定萌发的分生孢子的数量，也可以确定与分生孢子活性相关的数值。我们可以通过原始数据分析出每种制剂（或制剂成分本身）如何影响分生孢子活性，还可以利用一些统计工具来确定哪种成分对真菌分生孢子的危害较小。使用软件的优点之一是可以直接使用分生孢子萌发法获得的图像，通过分析已有的图像便捷地获取的额外信息。在使用常规制剂助剂和其他添加剂进行研究时，掌握分生孢子的行为信息越多，你的制剂开发计划更有目的性，有助于节省制剂的研究时间。
结束语
综上，本文介绍的所有方法都存在优点和缺点，其相互之间没有可比性，所有的方法可以互为补充。结合不同的方法，可以准确获知微生物与不同成分的相互作用。因此我们推荐将本文讨论的所有方法运用到制剂开发项目的不同阶段中，快速识别可能会在配方设计中带来问题的成分，从而节省制剂开发的时间和资源。
本文提到的所有方法在禾大微生物实验室的内部项目中均有运用，且主要用于配方开发项目中。此外，禾大还具备其他多种研发能力，比如，生测中心（在禾大新成立的产品体验中心）和应用模拟研究（禾大新建喷雾研究室）等，我们将生物测试技术与这些能力相结合，助力微生物农药在田间发挥最佳性能。
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