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农业中的微生物
微生物农药和生物刺激剂能够增强植物抵御生物和非生物胁迫的能力。因此，这些产品是农业中非常重要且维持持续性的物品。然而，即使对于目前市场上的微生物产品而言，保持细胞活力以具备较长的保质期仍是一个长期存在的挑战。制剂配方在应对这一挑战中发挥着至关重要的作用。提供低水分活度环境的载液可以使微生物细胞的活力保持稳定，而含水载体通常并不适用。CITROFOL® AI（柠檬酸三乙酯）是一种油状，不含水，但具备部分水溶性的液体，是配制无尘，易于剂量，且保质期长的微生物产品适用的载体。
CITROFOL® AI是Jungbunzlauer受全球认可的一个柠檬酸酯品牌。该产品是一种透明，无色，无味的油性液体，通过发酵的原料进行酯化作用，使其100%生物基且可生物降解。
CITROFOL® AI的理化特性使其在操作和配方方面具备明显的优势。产品不易燃，无挥发性，符合2004/42/EC法规的要求，此外产品无毒，可确保安全的储存和操作。CITROFOL® AI的水溶性高达 58 g/L，可按相应用量均匀稀释于水中，无需乳化剂，可简化配方。产品可在低温下保持稳定，并在宽泛的温度范围内具备良好的流动性。CITROFOL® AI被列入国际化学品名录，并且符合欧盟REACH法规要求。在美国，柠檬酸三乙酯被批准为惰性成分的农产品材料于食物和非食物上，并且遵循40 CFR Part 180的要求。此外，CITROFOL® AI还通过了美国农业部 BioPreferred®的认证，使这一生物基产品适合特定类别的应用。
微生物活力测试
为了评估CITROFOL® AI对微生物活力的影响，从市场上采购了极具商业价值的微生物制剂。这其中包括革兰氏阳性细菌贝莱斯芽孢杆菌（可湿性粉剂和水悬浮剂），以及真菌哈茨木霉和球孢白僵菌（均为可湿性粉剂）。将可湿性粉剂产品与 CITROFOL® AI混合来制备细胞悬浮液。所有制剂和商业产品均在40°C和/或室温下储存长达6个月的时间，并通过平板计数法定期评估细胞活力。
贝莱斯芽孢杆菌的细胞活力
产孢细菌贝莱斯芽孢杆菌已在40°C具有挑战性的情况下进行了储存监测。尽管条件恶劣，贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂产品在6个月的测试期间表现出了抗逆能力，并完全保持了活力。相比之下，商用贝莱斯芽孢杆菌水悬浮剂在相同40°C和6个月的监测期内，细胞活力从1.5 x 1010 CFU/g下降至4.3 x 108 CFU/g。虽然不如可湿性粉剂那么稳定，但悬浮在 CITROFOL® AI 中已提高了液态产品的活性和保质期。在高温下的6个月内，贝莱斯芽孢杆菌的活力从1.5 x 109 CFU/g 略微下降至4.8 x 108 CFU/g，下降不到一个数量级（图 1）。
图1：在高温（以加快储存测试）下储存的贝莱斯芽孢杆菌的细胞活力，将商用可湿性粉剂与商用水悬浮剂和CITROFOL® AI中的非水悬浮剂进行比较。起始活力的差异是由产品中不同的细胞浓度造成的。
哈茨木霉的细胞活力
研究发现哈茨木霉更容易受到高储存温度的影响，但在40°C监测下其6个月的保质期仍然可行。在此期间，可湿性粉剂产品的细胞活力明显下降，从1.8 x 109 CFU/g降至5.1 x 104 CFU/g。然而，将其悬浮在CITROFOL® AI中可以减少这种损失：在测量期结束时，CITROFOL® AI 悬浮液的活力为2.7 x 106 CFU/g，在对比之下，几乎比粉剂产品高出两个数量级。
图2：在高温（以加快储存测试）下储存的哈茨木霉的细胞活力，对比商用可湿性粉剂与CITROFOL® AI中的悬浮液。可湿性粉剂在12周时的数据点低于检测限度。
球孢白僵菌的细胞活力
在目前测试研究的微生物当中，球孢白僵菌对高储存温度最为敏感。为了提供更好的解决方案，保质期在室温和40°C下进行了监测。在仅两周之后，可湿性粉剂产品中的细胞活力已从5.3 x 108 CFU/g降至约1.0 x 103 CFU/g的检测阈值以下。
在相同条件下，CITROFOL® AI中的悬浮液在两周后仅略微降至1.1 x 108 CFU/g，并在12周后保持高达1.0 x 106 CFU/g（图 3）。正如预期之中，球孢白僵菌制剂在室温下储存时活力下降得更慢。在这些条件之下，24 周后可湿性粉剂产品中的细胞计数从5.3 x 108 CFU/g降至4.1 x 107 CFU/g。CITROFOL® AI中的保质期甚至更长，当测试开始时，细胞计数为2.5 x 108 CFU/g。当测试结束时细胞计数为 1.6 x 108 CFU/g（图 4）。
我们的观察结果与已发表的研究结果一致，在油性载体中配制时，球孢白僵菌对高温的耐受性有所提高。[1]
图3：在高温（以加快储存测试）下储存的球孢白僵菌的细胞活力，对比商用可湿性粉剂与CITROFOL® AI中的悬浮液。
图4：室温下储存的球孢白僵菌的细胞活力，对比商用可湿性粉剂与CITROFOL® AI中的悬浮液。
优化液体流动
载液与配方相关的物理特性是需要考虑的重要事项。以3.0 wt%的低用量添加疏水性气相二氧化硅已足够按需改变CITROFOL® AI的流变性能。在 0.01秒-1的低剪切速率下，增稠流体的表观粘度约为100,000 mPa·s，这表明了可有效稳定的分散细胞以防止沉降。同时，增稠的流体表现出很强的剪切稀化特性，当剪切速率增加到10秒-1时，粘度明显降低100倍，约为1,000 mPa·s 左右（图 5）。这些数据表明，增稠CITROFOL® AI 的配方具有良好的流动性和剂量性。
图5：用不同量的疏水性气相二氧化硅增稠的CITROFOL® AI的流动曲线。
结论
我们的研究结果证实了柠檬酸酯CITROFOL® AI作为微生物载液的适用性。CITROFOL® AI是一种可持续的辅助配方剂，具有高度安全性和良好的理化特性。值得注意的是，它结合了油性载体的低水活性和部分水溶性，无需使用乳化剂和防腐剂，简化了配方。CITROFOL® AI与植物完全相容，具有延长液体微生物制剂保质期的巨大潜力，本研究中测试的所有生物（贝莱斯芽孢杆菌、哈茨木霉、球孢白僵菌）中都得到了验证。
即使在高温条件下，该产品也能帮助保持较高的细胞活力，这对于在温暖气候条件下耕种的农民或在运输和储存过程中需要持续冷却的产品来说至关重要。
确保高细胞活力和延长保质期是克服微生物商业化障碍的一大进步。具备活力的微生物细胞是其在田间发挥令人满意的功效不可或缺的条件，以此能够提升人们对这些可持续的作物用品的功效和经济可行性的信心。可存活的微生物细胞能取得令人满意的结果，从而增强大众对于作物投入的效益和经济的信心。
参考
[1] Oliveira DGP, Lopes RB, Rezende JM, Delalibera Jr I. Increased tolerance of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae conidia to high temperature provided by oil-based formulations. J. Invertebr. Pathol. 2018;151:151–157.
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