世界农化网中文网报道：青苔病是一类寄生在果树叶片及茎干上的一类由水藻为主混合多种微生物的寄生性病害。柑橘是其危害较为严重的一类果树，发病严重时会大规模影响柑橘的产出。柑橘作为全球最重要的经济作物之一，在热带、亚热带地区均有种植。近年来世界柑橘种植面积稳步增长，据联合国粮食及农业组织（FAO）数据，2000~2015年由876.73hm2增至1343.27 hm2[1]。同时根据近年来柑橘逐年效益递增，让越来越多的人投身柑橘种植产业，柑橘种植密度增加。据调查统计，柑橘青苔病的爆发几率近年来呈上升趋势，仅在中国每年大约有1300万亩柑橘果园受青苔病的危害，占到柑橘总面积的30%。
柑橘青苔病容易在潮湿多雨环境中滋生，发病时主要危害柑橘的枝干、叶片以及果实等部位，减弱植株的光合作用速率，降低光合作用产物，会直接影响果实的色泽、外观和内在品质。覆盖在地面上的青苔病会抢占肥水并阻滞水分的渗透，影响土壤内气体的交换，严重影响果树生长发育，导致柑橘产量大大降低。
目前，防治青苔病主要依赖化学药剂乙蒜素、代森铵、过氧乙酸、以及一些无相关资质的助剂产品。然而，这些产品在青苔病的防治靶标上均未正式登记，存在潜在的安全风险。此外，这些化学药剂本身又存在强刺激性气味、混配性差、容易发生药害、以及质量层次不齐等问题。随着人们对环境问题的日益关注，有机绿色农业面积的逐步增大以及消费需求的升级，全球市场对果品的品质、质量安全、用药安全、生产溯源等要求越发严苛。因此，开发新型、安全、高效和对环境友好的新型天然产物生物农药防治青苔病迫在眉睫。
关于小檗碱的研究
小檗碱（berberine，Ber）亦称黄连素，是从药用植物黄连中提取分离得到的一类季铵型异喹啉类生物碱，为黄色针状结晶，味苦，主要存在于毛莨科植物黄连、黄柏、三棵针中，含量可达10％左右，呈盐酸盐形式存在。黄连入药在中国有着悠久的历史，最早的文献记载为《神农本草经》[2]。根据它的历史记载数据，现今医学领域对黄连素进行了深入的研究，发现它能治疗各种感染性疾病，主要是消化道细菌感染，还有呼吸道感染、皮肤科感染等，可以广谱抑制病原微生物[3-4]。
有研究报道，小檗碱在极低浓度下即可阻止霍乱、肠伤寒、痢疾菌的繁殖，它也有抗金黄色葡萄球菌、链球菌等革兰氏阳性菌和肠伤寒菌、志贺氏痢疾菌、淋菌等革兰氏阴性菌的作用，此外，对蜡样芽胞杆菌、枯草杆菌、白喉杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌、新城型痢疾杆菌、化脓性链球菌、结核菌等动物病原菌以及念珠菌属、隐球菌、酵母等真菌均有抗菌性。随着科技水平的飞速发展，发现小檗碱抗金黄色葡萄球菌，主要是通过导致核糖体和细胞壁的改变而干扰了细菌蛋白质生物合成所致[2]。
然而小檗碱的功能不仅只限于抗菌的作用，很多研究者发现,小檗碱在治疗肿瘤、糖尿病、心血管疾病、高血脂、病毒感染、脑缺血性损伤、精神疾病、阿尔茨海默病和骨质疏松等多方面具有药理作用。可见小檗碱的生理功能十分丰富，潜在的开发应用价值非常大。近十年来,已经有2000多篇文献报道了小檗碱的临床药效、药理机制、吸收代谢、构效关系等研究结果。其中研究得较为系统的是针对抗菌、抗疟、抗心律失常、抗肿瘤所作的构效关系研究[5]。但在农药领域的研究应用报道却是屈指可数，其未来拥有巨大的发展潜力。
近十年来，随着对小檗碱在农业领域的深入研究，发现小檗碱在防治柑橘树青苔病方面有显著的作用，开创了小檗碱在农药领域全新的研究及应用方向。并充分利用中国植物资源优势，打破传统并在农业领域不断创新，采用先进生物技术，将小檗碱这一全新天然产物带入到了植保领域。资料显示，来自于中国的生物科技企业-成都新朝阳作物科学股份有限公司（以下简称″新朝阳″）基于对黄连高效共同提取技术创新研发，解决了传统黄连提取产物活性成分单一、对农业病害防治效果差等问题，创新开发出了″0.5%CE小檗碱水剂″，能够有效控制柑橘树青苔病的发生，更有利于保证果品的品质，减少传统化学药剂的使用和降低对化学农药的依赖性。
图1：黄连药用部位
小檗碱防治柑橘青苔病病最新研究进展
（1）小檗碱作用机制研究
随着生物科学技术的飞速发展，通过高通量测序技术（IlluminaMiseq），新朝阳科研人员对附着青苔病的柑橘叶片进行了微生物群落组成、结构、多样性进行了研究，分析发现附着在柑橘叶片的青苔病致病叶际微生物种类超过100种（图2），可能的病原物为不可培养的虚幻球藻属球藻unculturedApatococcus sp，黄绿异小球藻Heterochlorellaluteoviridis.柄杯梗孢Cyphellophorasessilis，胶胞炭疽菌C.gloeosporioides等，从病原物类群可以推断，青苔病是由多种藻类及真菌复合侵染造成的[6-7]。
图2：柑橘青苔病叶际微生物物种分析
实验数据标明，小檗碱能够对附着在叶面及枝干上的水藻及其共生菌产生严重的抑制及破坏作用。小檗碱类化合物对拓扑异构酶Ⅰ（TOPⅠ）和拓扑异构酶Ⅱ（TOPⅡ）活性有一定的抑制作用，并且发现小檗碱与 DNA有很强的结合作用[8]。另外，小檗碱会抑制麦角甾醇的合成，使细胞膜通透性增大，从而造成细胞内物质如核酸、蛋白质的泄露，同时造成菌体细胞膜膜电位去极化和脂质过氧化，使活性分子无障碍进入藻类胞质[9]，迅速抑制藻类生长和繁殖，使藻类细胞器丧失功能，光合作用受阻最终死亡。
图3、0.5%CE小檗碱处理后5天TrypanBlue染色显示细胞破裂（左图为清水对照、右图为药剂处理）
将柑橘叶片青苔病覆盖层制作成悬浮液，与0.5%CE小檗碱水剂混合培养，培养5天后对其进行TrypanBlue染色，根据TrypanBlue染色原理，当细胞损伤或死亡时，TrypanBlue可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。可以明显看出0.5%CE小檗碱水剂处理后，细胞5天全部着色，0.5%CE小檗碱水剂通过损伤青苔病细胞膜造成细胞死亡，以致达到清除青苔病的作用（图3）。
（2）小檗碱提取工艺研究
基于小檗碱自身药理特性，经过多年的研发积累，新朝阳通过共同提取技术（Co-extraction technology）研究思路及方法，对黄连根中的活性物质大幅挖掘，通过工艺的大幅优化，获得了更多有益成分。利用该技术在保证指示成分含量的同时，尽可能多的保留了其他活性组分（图4）。中国农药信息网检索显示，该技术成果于2022年4月获得中国农业农村部ICAMA批准的0.5%小檗碱水剂产品登记，成为全球首个正式登记防治青苔病的植物源农药（图5）。
图4：CE小檗碱主要活性成分（数据来自企业标准信息公共服务平台）
图5：小檗碱防治柑橘树青苔病登记信息
（3）0.5% CE小檗碱制剂研究进展
以先进的提取工艺作为支撑，辅以优异制剂技术，使得药剂表面张力小，促进药液渗透快速渗透至藻类致病混合物覆盖层，增强有效成分效果（图6）。入水分散性好，分散后溶液透明，呈均相状态，可快速润湿渗透。多重光散射稳定性数据显示，0.5%CE小檗碱水剂稳定性好（图7），完全满足各种田间施药环境。
图6: 0.5%CE小檗碱水剂稀释150倍动态表面张力测试
图7：0.5%CE小檗碱水剂制剂性能
（4）0.5%CE小檗碱水剂应用技术研究
新朝阳独家推出的这款源于植物用于植物的0.5%CE小檗碱水剂是防治柑橘树青苔病的重要推广技术。在创新技术的加持下，药剂的速效性优异，5-7天见效，医药级成分毒性低，防治效果优异，田间防效最高能达到95%以上，防治效果达到化学药剂乙蒜素。同时，0.5%CE小檗碱水剂作为一个天然产物植物源生物源农药，在优异的防效基础上，其在不同作物上全程使用更加安全、不伤果、不伤叶、无挥发性刺激气味、速效性好和对环境友好。
采用快速稳定的离体检测方法对0.5%CE小檗碱水剂进行活性测定，5天后分析对比可以明显看出0.5%CE小檗碱水剂处理后柑橘叶片上的青苔病附着层死亡泛白，叶绿素被破坏，效果与化学药剂乙蒜素相当，具有显著的防治效果。
0.5%CE小檗碱水剂在中国四川眉山针对柑橘树青苔病初发期进行防治，药后5天可以看到青苔逐步变白，10天后的防效达到70.37%，最终药后12天其防效达到98.58%，彻底使柑橘青苔病附着层死亡并出现脱落，并未对叶片造成损伤，相较乙蒜素的使用，没有任何异味散发（图9）。
图10、0.5%CE小檗碱水剂在赣州市吉谭镇脐橙青苔病的防治
中国江西赣州市吉谭镇脐橙青苔病高发期，整个树干均披上一层厚厚的青苔病，使用0.5%CE小檗碱200倍10天后，致病藻类被破坏死亡并脱落，防治效果显著，防效达到97%，果树枝干未出现损伤，相较乙蒜素的使用，没有任何异味散发（图10）。
图11、0.5%CE小檗碱水剂在恩施市上坝镇茶叶青苔病的防治
中国湖北恩施市上坝镇茶叶青苔病趋重发生，在高发期喷施0.5%CE小檗碱200倍14天后，青苔全部变枯发黄，变白枯死，其附着在根部的苔藓也枯黄死亡，防治效果显著（图11）。
图12 0.5%CE小檗碱水剂在四川蒲江鹤山镇柑橘青苔病的防治
四川省蒲江市鹤山镇柑橘青苔高发期，喷施0.5%CE小檗碱水剂150倍5天后，柑橘叶片上的绿藻青苔病变白枯死，防治效果显著，防效达到98.7%，与化学对照乙蒜素有同样的防治效果，即时解决了大量青苔附着影响柑橘光合作用的问题。
图14、不同浓度0.5%CE小檗碱水剂药后12天后对柑橘不知火和春见的叶片安全性试验情况
0.5%CE小檗碱水剂在中国四川眉山进行安全性实验测试，2种柑橘品种春见和不知火在膨果期和嫩叶期进行了安全性测试，结果显示在高浓度和低浓度下，0.5%CE小檗碱水剂对柑橘果实和嫩叶均无药害现象，安全性极高。
以上田间生测结果表明，不论地域性及作物部位，初发期和高发期，0.5%CE小檗碱水剂都对柑橘树青苔病表现出了优异的防治效果，其防效达到化学农药水平。且无刺激性气味散发，对施药人员友好，药剂附着性很好。同时，经安全性实验检测，在推荐使用浓度下，在作物的萌芽期、花期、幼果期等时期施用安全，对嫩芽、花及果实膨大均无影响。对天敌等非靶标生物安全、对环境友好。
对于生物农药、天然产物农药的应用，是以发生前和发生初期是其最佳的防治时期，不仅可以最大化发挥生物农药的防治效果和防治价值，而且可以把病虫草害对农业影响损失降到最低。在病虫害高发期，选择生物农药、天然产物农药与化学农药（包括化学农药减量）搭配使用，因两类药剂作用机理的巨大差异，协同增效更显著，在降低化学农药用量、减缓化学农药抗药性的同时，提高了农产品质量安全、改善了农业生态环境、减轻了环境压力、维系了生物多样性和推动农业产业价值提升。
基因编辑技术有效推动黄连产业健康发展黄连（CoptischinensisFeanch）属毛茛科多年生草本植物，主要分布于中国川、黔、滇、鄂等省的高寒山区，为中国西南部名贵中药材之一。由于黄连生长缓慢，栽培难度大，不易普及；加之部分地区长期只挖不栽，造成资源枯竭，市场供应日益紧张。为促进黄连产业化发展，依据科技水平的发展，建立优质种苗繁育基地，对黄连的产业化发展提供多样化的生产方法，在掌握黄连品种资源的基础上，通过对黄连种群各品系间个体性状与产量和质量的遗传相关性研究分析，筛选出优质高产优良品系；同时，借助于已较成熟的TDNA片段基因整合技术，对个体性状进行改良，培育出优质品种，提高品种纯度，优化产品质量；利用组织培养等技术手段，加快优质种苗的推广速度[10]。这些技术和方法都已为黄连产业的健康发展提供了有力保障。
据不完全统计，截止2021年底，青苔在中国有近10亿元的市场容量，在全球预计有近30亿元的市场容量，且每年以10%的平均复合增长率在快速增加。依托丰富的自然资源和日益提升的生物技术水平，创新研发出具有安全、高效、无残留等特点的天然产物农药-0.5%CE小檗碱水剂，不仅可以解决农业生产中青苔病带来的光合效率降低、致使树体生长不良、树势衰退和品质产量下降等问题，而且有助于提高农产品质量安全、延缓化学农药抗药性、减少对化学农药的依赖性和维系生物多样性。同时，有利于增强农产品的竞争力，对推动农药产业结构升级，促进农业绿色可持续发展，具有重要的经济意义和社会意义。
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